一个具有条锈病和白粉病抗性且依赖于光照强度的小麦类病斑突变体的鉴定及其候选基因的精细定位

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封面文字介绍： 本研究从生理、生化和遗传等方面鉴定了一种新的光强依赖性类病斑突变体，并将Lm5基因定位在1.28 Mbp区间，包含17个高可信度基因。

小麦是世界上重要的粮食作物之一，它大约提供了人类20%的能量。由于95%的能量来自于叶片的光合作用，因此叶片在提高作物产量方面发挥着关键作用。类病斑突变体是斑点叶突变体的一种，即在不受外部病原菌感染、环境胁迫或机械损伤的情况下，在叶片、叶鞘及其它组织上自发产生细胞死亡或坏死斑点的一类突变体。斑点的形成可能导致植物早衰，甚至严重影响植物的生长发育。虽然在水稻中已经报道了许多类病斑突变体，但是在小麦中我们对类病斑基因的分子功能了解还非常有限。

1. 类病斑表型及其对农艺性状的影响

在田间条件下，类病斑首先出现在基部叶片的顶端(图1a)。然后，随着植株的生长发育，突变体从分蘖期到开花期，类病斑的大小和数量都在增加。最终突变体MC21的叶鞘、茎、颖壳和芒上都表现出斑点(图1b)。与野生型川农16相比，突变体的株高、穗长、穗茎长、千粒重、粒长、粒宽、有效分蘖和旗叶宽显著降低，开花期显著延迟，旗叶长显著升高，而小穗数无显著差异(图1c)。

图1 类病斑突变体MC21和野生型川农16的表型特征

2. 类病斑表型依赖于光照

用锡箔纸覆盖川农16和MC21(无斑点)的新叶，探究自然条件下光照对斑点形成的影响。突变体MC21遮荫部分叶片逐渐变白，没有斑点产生，而未遮荫部分出现了大量的斑点。遮光处理前后川农16均未出现斑点。

3. 光合作用指示及叶绿素含量

拔节期，在弱光条件下MC21和川农16的叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素水平没有显著性差异(图2c，上)。在自然条件下，与川农16相比，MC21叶片中的叶绿素 a、叶绿素 b水平分别显著降低了56.21%和57.14% (图2c，下)。

4. 细胞和叶绿体的超微结构分析

叶绿素含量的降低可能与叶片中叶绿体的数量有关。为了确定叶绿体结构对叶片斑点的影响，我们观察了川农16和突变体MC21拔节期叶片的细胞结构。在川农16的叶片中，大量的叶绿体有规律地排列在细胞膜周围，淀粉粒清晰可见；然而突变体MC21的叶绿体数量明显减少；叶绿体膜被破坏，类囊体暴露在细胞基质中，囊泡和质体小球的数量大量增加(图2e)。

图2 突变体MC21的斑点形成、光合色素含量及叶绿体结构观察

5. 细胞死亡与H₂O₂和O₂^-的积累有关

MC21突变体斑点周围被台盼蓝染成深蓝色，表明MC21斑点的产生伴随着细胞死亡(图3a)。为了进一步确认细胞死亡是否与突变体MC21中活性氧的爆发有关，我们测量了叶片中的酶活性(过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶)和活性氧含量(H₂O₂和O₂^-)。与野生型川农16相比，突变体MC21斑点叶片中过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性分别显著降低了15.11%和41.63%，过氧化氢酶活性显著升高了68.82%。O₂^-含量显著降低了36.72%，H₂O₂含量增加了25.07%。结果表明，活性氧清除系统严重受损，活性氧(尤其是H₂O₂)的过度积累与细胞死亡有关。

图3 川农16和MC21叶片中细胞死亡鉴定和活性氧相关指标分析

6. 类病斑的形成增强了抗病能力

在培养箱对MC21和川农16的条锈病、白粉病和赤霉病抗性鉴定。川农16对白粉病(图4a，左)、条锈病(图4b，左)和赤霉病敏感(图4c，左)；在强光照条件下，MC21对白粉病(图4a，右)和条锈病(图4b，右)的抗性显著增强，但20天后仍然对赤霉病敏感(图4c，右)。然而在弱光条件下，MC21(无斑点)和川农16对条锈病和白粉病敏感。因此，川农16对条锈病、白粉病和赤霉病都表现出易感，而突变体MC21斑点产生后对条锈病和白粉病的抗性显著增强。

此外，对其防御基因的表达进行了分析发现：在拔节期，突变体MC21(有或无病变斑点)中所有防御反应基因相比于川农16均明显上调(图5)， 表明抗病水平的提高与防御反应基因的表达增加有关。

图4 川农16和MC21在培养箱中的抗病性评估

图5 拔节期川农16和MC21防御相关基因的表达分析

7. Lm5基因的遗传分析与定位

小麦660K SNP芯片被用来分析川农16和MC21两者之间的遗传背景。除去杂合的标记后，只有13411个纯合的SNP(~2.52%)在川农16和MC21之间具有多态性，表明MC21与川农16具有相似的遗传背景，MC21突变体确实是由川农16诱变而来的(图6a)。为了进一步确认类病斑表型的遗传方式，我们将MC21与3642品系、川农16和蜀麦969进行杂交。所有F₁植株以及蜀麦969/MC21的正反交都表现出斑点表型，表明斑点的产生受到核基因的控制。此外，MC21/3642和MC21/蜀麦969构建的F₂群体符合3:1分离比。MC21/3642、MC21/蜀麦969和MC21/川农16构建的F_2:3家系符合1:2:1分离比。因此，我们认为斑点的产生是由一个半显性核基因控制的。我们用BSR-Seq方法将目的基因定位在KASP标记KASP-4211和KASP-5353之间，遗传距离为4.3 cM，物理距离为23.23 Mbp (图6c)。

图6 突变体MC21的遗传背景分析、BSR-Seq分析和初定位

8. Lm5基因的精细定位

为了进一步精细定位Lm5基因，我们新开发了9个KASP标记在MC21/3642构建的F₂次级群体(3828个单株)中筛选到了38个重要的重组单株，根据它们的基因型和表型数据，最终将Lm5基因定位在KASP-5825和KASP-9366之间的1.28 Mbp区间 (图7)。锚定到中国春参考基因组上，该区间共包含46个已注释基因(包括17个高可信度基因和29个低可信度基因)。

此外，利用RNA-Seq (MC21/川农16)数据获得的差异表达基因筛选可能的候选基因。下调和上调的差异表达基因主要富集在代谢途径、次生代谢产物的生物合成途径和氨基酸的生物合成途径(图8)。9096个差异表达基因中有509个分布在2A染色体上，在精细定位区间内含有TraesCS2A02G421500和TraesCS2A02G422100两个基因，他们都编码半胱氨酸蛋白酶，可能为候选基因。

图7 Lm5基因的精细定位

图8差异表达基因的富集分析

全文总结

类病斑突变体是研究植物抗病性、程序性细胞死亡和光合作用通路等机制的理想材料。本研究利用甲基磺酸乙酯从川农16诱变池中获得了一个光强依赖型的遗传稳定类病斑突变体(MC21)。幼苗期，突变体基部的叶片最先表现出细小的斑点，随着植株的生长和发育类病斑逐渐扩散到叶鞘、茎、颖壳和芒上。与野生型川农16相比，突变体MC21不仅表现出主要农艺性状的显著性改变，还表现出叶绿体退化、叶绿素含量降低、活性氧水平升高以及抗条锈病和白粉病能力增强。遗传分析表明，类病斑表型受一对位于细胞核的单基因（半显性）控制。利用MC21/3642构建的F_2:3家系结合BSR-Seq技术将目的基因定位在2A染色体长臂KASP标记KASP-4211和KASP-5353之间，暂命名为Lm5，进一步精细定位将目的基因定位于KASP-5825和KASP-9366两个标记之间。锚定到中国春（CSv2.1）参考基因组上，精细定位物理区间为1.28 Mbp，在该区域包含17个高度可信的候选基因。这些结果不仅为Lm5候选基因的筛选奠定了重要基础，也将有助于解析类病斑突变体的形成机制和抗病机制。

该结果于2021年 10月18日在线发表在Theoretical and Applied Genetics杂志上（Characterization and fine mapping of a lesion mimic mutant (Lm5) with enhanced stripe rust and powdery mildew resistance in bread wheat (Triticum aestivum L.）。文章链接：DOI: 10.1007/s00122-021-03973-1

该研究得到国家自然科学基金、四川省科技厅国际科技合作与交流项目、四川省科技厅应用基础研究项目、贵州省科技基础研究项目、四川农业大学双支计划项目、国家大学生创新训练计划项目和四川农业大学科研兴趣项目等的资助。

主要参考文献：

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